Accueil Santé & Bien-être Les sialoglycanes O-liés affectent le clivage de la pointe du SRAS-CoV-2

Les sialoglycanes O-liés affectent le clivage de la pointe du SRAS-CoV-2

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Dans une étude récente publiée sur le site Web de l bioRxiv* Des chercheurs d’Espagne, du Royaume-Uni et des États-Unis ont utilisé des outils chimiques pour découvrir les détails moléculaires de la modulation par les glycanes de la transformation de la pointe (S) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2).

Étude : O-Linked Sialoglycans Modulate the Proteolysis of SARS-CoV-2 Spike and Contribute to the Mutational Trajectory in Variants of Concern. Crédit image : NIAID Étude : Les sialoglycanes O-liés modulent la protéolyse du pic du SRAS-CoV-2 et contribuent à la trajectoire mutationnelle des variantes préoccupantes. Crédit image : NIAID

Contexte

Le S du SRAS-CoV-2 est une glycoprotéine trimérique à plusieurs domaines, dotée d’un revêtement dense de glycanes. Le site de clivage polybasique (séquences peptidiques riches en arginine) de la furine (FCS) dans le S complet (FL-S) renforce la liaison aux récepteurs des cellules hôtes après avoir été clivé par la furine ou la protéase transmembranaire sérine 2 (TMPRSS2). Le clivage protéolytique accru de la FL-S en sous-unités S1 et S2 a été attribué à un polymorphisme entre les résidus d’acides aminés (AA)/peptides glutamine (Gln)675 et proline (Pro)681 précédant le FCS. Notamment, cette région peptidique du SARS-CoV-2 S abrite également de multiples résidus AA de sérine (Ser) et de thréonine (Thr) qui peuvent porter des glycanes de N-acétylgalactosamine (O-GalNAc). Selon les auteurs, la glycosylation O-GalNAc liée à Ser/Thr a un impact sur le clivage du S médié par la furine et TRMPSS2.

Cette portion AA est également la plus sujette aux mutations ; par la suite, dans les variantes Alpha et Delta du SRAS-CoV-2 (VOC), plusieurs mutations sont hébergées entre Pro681 vers l’histidine (His) et l’arginine (Arg), respectivement. Dans toutes les sous-lignées Omicron, y compris BA.1, BA.2 et BA.5, on trouve des mutations en P681H et N679K. Toutes ces mutations ont un effet de renforcement du clivage protéolytique S. L’étude de ce tronçon peptidique dans le SARS-CoV-2 S constitue un défi analytique en raison de sa complexité biosynthétique et de l’absence d’une séquence peptidique consensus. De plus, il y a un manque de données sur l’abondance des glycanes, leur(s) site(s) d’attachement et leur influence structurelle sur la protéolyse. En outre, les études ont à peine examiné le rôle des mutations du COV du SRAS-CoV-2 sur la glycosylation de l’O-GalNAc.

Il existe une famille de 20 isoenzymes de GalNAc transférase, GalNAc-T1 à T20, dont les substrats varient. L’identification des sites de glycosylation de chaque GalNAc-T pourrait permettre de mieux comprendre la biologie des O-glycanes. Dans une étude précédente, Ten Hagen et al. ont trouvé sept isoenzymes capables d’introduire du GalNAc dans le S. SARS-CoV-2.

A propos de l’étude

Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé une tactique d’ingénierie chimique appelée « bump-and-hole (BH) engineering » pour étudier les isoenzymes GalNAc-T individuelles dans la cellule vivante. En outre, ils ont insisté sur le fait que l’amélioration du séquençage des glycopeptides basé sur la fragmentation pourrait permettre une analyse améliorée basée sur la spectrométrie de masse (MS).

Tout d’abord, les chercheurs ont incubé la souche recombinante S de SARS-CoV-2 de type sauvage (WT) avec des constructions P681R (ou P681H) produites dans des cellules humaines Expi293-F avec des versions WT ou BH de GalNAc-T1 ou T2. Ensuite, ils ont procédé à l’amorçage de ces constructions avec le nucléotide-sucre uridine diphosphate (UDP)-GalN6yne. Ils ont marqué les versions glycosylées par cycloaddition azide-alkyne catalysée par le cuivre(I) (CuAAC) pour une visualisation via le blot de streptavidine. Ce traitement a permis d’introduire le GalN6yne de manière isoenzyme-spécifique tout en conférant aux glycopeptides une charge positive supplémentaire qui a facilité l’analyse par SM.

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a) Modèle et dessin de la pointe du SARS-CoV-2. Site de clivage de la furine et alignement peptidique pour les variants COVID- 19 des coronavirus concernés et apparentés. Le motif polybasique du SARS-CoV-2 est surligné en jaune. Les caractères gras et rouges correspondent à des changements d’acides aminés aux positions 679 et 681. b) La technique de la bosse et du trou permet le marquage spécifique de l’isoenzyme GalNAc-T des substrats de glycosylation en utilisant le substrat cliquable UDPGalN6yne. FCS = site de clivage de la furine ; VOCs = variants préoccupants.

Ensuite, l’équipe a soumis les sous-unités FL-S et S1/S2 à une digestion en gel et les a analysées par MS en tandem (ETD). Ils ont utilisé la dissociation induite par collision à haute intensité (HCD) pour obtenir les séquences peptidiques nues et la composition des glycanes, puis ont utilisé l’ion de diagnostic I-tagged-GalN6yne pour déclencher la fragmentation ETD du squelette peptidique. Les chercheurs ont également validé les résultats de l’étude in vitro. À cette fin, ils ont utilisé la glycosylation de protéines S exprimées de manière recombinante avec des versions solubles de BH-GalNAc-T1 et de BH-GalNAc-T2 et la CuAAC avec de l’azide marqué I et l’analyse glycoprotéomique MS.

L’équipe a utilisé un panel de peptides synthétiques pour étudier l’effet des mutations de la protéine S sur la glycosylation médiée par GalNAc-T1. Ces peptides présentaient des mutations liées au COV du SRAS-CoV-2 aux principaux points chauds : Gln675, Gln677, asparagine (Asn)679, et Pro681.

La glycosylation module le traitement protéolytique S en fonction de la distance au site de clivage et de la composition du glycan. L’équipe a donc cherché directement à savoir si les glycanes O-GalNAc sur Thr678 modulaient le clivage de S par la furine en utilisant des peptides substrats synthétiques actifs par transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET). Les peptides couvrant les résidus Gln 672 à 689 contenaient le 2-aminobenzoyl N-terminal et le 3-nitro-Tyr C-terminal comme parties donneuses et quencheuses de fluorescence, respectivement. Une augmentation de l’intensité de la fluorescence indique un clivage S médié par la furine. Tout d’abord, ils ont comparé des substrats non glycosylés correspondant à l’épi WT (FRET-1) et à l’épi mutant P681H (FRET-2). En outre, ils ont soumis le TMPRSS2 recombinant aux substrats FRET glycopeptidiques FRET-1, FRET-3, et FRET-7 à FRET-9.

Résultats de l’étude

La validation informatique et manuelle a révélé que Thr678 portait de la GalN6yne modifiée par marquage I dans les échantillons FL-S et S1 uniquement dans les cellules exprimant BH-T1. La thréonine (Thr)323 glycosylée par BH-T1 et BH-T2 n’avait été associée à aucune isoenzyme GalNAc-T. L’analyse FRET a révélé que l’élaboration de glycanes O–GalNAc sur la Thr678 de la S-glycoprotéine du SRAS-CoV-2, notamment avec des modifications chargées négativement, entravait gravement l’activité de la furine. Les O-glycanes dans les cellules épithéliales pulmonaires exprimant GalNAc-T1 suggèrent que la glycosylation est une modification physiologiquement significative qui limite la maturation de la protéine S au cours de l’évolution.

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Selon les auteurs, la perturbation de la glycosylation O-GalNAc a été une force motrice majeure de l’évolution des COV du SRAS-CoV-2. Dans la trajectoire d’évolution des COV du SARS-CoV-2 Alpha aux COV Delta et Omicron, des changements notables dans les séquences AA précédant le SFC indiquaient que le clivage protéolytique augmentait progressivement avec l’accroissement de l’infectivité du COV. La mutation analogue trouvée sur le COV Delta plus transmissible (P681R) a également été liée à une augmentation du clivage par la furine, suggérant une trajectoire évolutive qui supprime la O-glycosylation avant d’augmenter la reconnaissance intrinsèque par la furine.

Contrairement à la mutation P681H détectée dans les variantes précoces telles qu’Alpha, la mutation N679K dans Omicron n’a pas eu d’impact substantiel sur la glycosylation mais a entraîné une augmentation du clivage par la furine des peptides synthétiques. Ces mutations FCS-proximales ont agi en synergie et ont évolué pour supprimer la glycosylation et améliorer le clivage par la furine.

Conclusions

La présente étude a permis d’établir que la O-glycosylation est un déterminant clé du clivage et de la maturation du S du SRAS-CoV-2. Elle pourrait également être un vestige de souches ancestrales de SARS-CoV-2 perdues au cours de l’évolution virale.

Les chercheurs ont mis en évidence que la GalNAc-T1 amorçait la glycosylation à Thr678 dans les cellules vivantes. Le site de glycosylation à Thr678 du S (non proche du FCS) explique pourquoi un seul résidu GalNAc était insuffisant pour moduler l’activité de la furine et n’avait qu’un faible impact sur l’activité de TMPRSS2. Au contraire, l’élaboration et la sialyation abrogeaient l’activité furine jusqu’à 65%. De même, la O-glycosylation a eu un impact négatif sur le clivage de S par TMPRSS2, les O-glycanes contenant le noyau 1 (Galβ1-3GalNAc-) disaccharide ayant le plus d’effet. Dans l’ensemble, les résultats de l’étude soulignent la nécessité d’utiliser des techniques plus avancées de traçage des glycanes pour étudier l’évolution du SRAS-CoV-2.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et qui, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement en matière de santé ou être traités comme des informations établies.

Référence du journal :

  • O-Linked Sialoglycans Modulate the Proteolysis of SARS-CoV-2 Spike and Contribute to the Mutational Trajectory in Variants of Concern, Edgar Gonzalez-Rodriguez, Mia Zol-Hanlon, Ganka Bineva-Todd, Andrea Marchesi, Mark Skehel, Keira Mahoney, Chloe Roustan, Annabel Borg, Lucia Di Vagno, Svend Kjaer, Antoni G. Wrobel, Donald J. Benton, Philipp Nawrath, Sabine L. Flitsch, Dhira Joshi, Andres Manuel Gonzalez-Ramirez, Katalin A. Wilkinson, Robert J Wilkinson, Ramon Hurtado-Guerrero, Stacy A Malaker, Benjamin Schumann, bioRxiv preprint 2022, DOI : https://doi.org/10.1101/2022.09.15.508093, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.09.15.508093v2