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Identification d’un nouveau mécanisme utilisé par le SRAS-CoV-2 pour supprimer les réponses antivirales et rendre la cellule plus permissive à l’infection.

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Dans une étude récente publiée dans PLoS Pathogensles chercheurs ont évalué l’impact du cadre de lecture ouvert (ORF)-6 du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) sur la signalisation immunitaire innée.

Étude : L'ORF6 du SRAS-CoV-2 perturbe la signalisation immunitaire innée en inhibant l'exportation de l'ARNm cellulaire. Crédit image : Willyam Bradberry/Shutterstock
Étude : L’ORF6 du SRAS-CoV-2 perturbe la signalisation de l’immunité innée en inhibant l’exportation de l’ARNm cellulaire. Crédit image : Willyam Bradberry/Shutterstock

Contexte

Un bétacoronavirus appelé SARS-CoV-2 est à l’origine de la maladie virale mortelle du coronavirus 2019 (COVID-19). Il est urgent de comprendre la biologie moléculaire du virus et la manière dont il interagit avec la cellule hôte en raison de son impact significatif sur la santé humaine. Neuf protéines accessoires putatives codées par le SARS-CoV-2 sont considérées comme inutiles pour le fonctionnement du virus. in vitro et jouent probablement un rôle dans la modification du milieu cellulaire hôte pour favoriser la réplication virale.

A propos de l’étude

Dans cette étude, les chercheurs ont démontré que la protéine accessoire ORF6 du SRAS-CoV-2 interagissait avec la protéine cellulaire d’exportation d’acide ribonucléique 1 (Rae1) en empêchant l’exportation de l’acide ribonucléique messager (ARNm).

L’équipe a d’abord créé un panel de particules pseudo-virales (VLP) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH)-1 qui codaient pour chaque ORF afin de transduire une variété de lignées cellulaires différentes et d’induire l’expression de chaque protéine accessoire séparément pour examiner la fonction des protéines accessoires du SRAS-CoV-2. Les VLP ont été créées lorsque des cellules HEK293T ont été co-transfectées avec le VIH-1 Gag-Pol, VSV-G et un vecteur pLVX-StrepII-ORF contenant les gènes ORF3a, ORF3d, ORF6, ORF7a, ORF7b, ORF8, ORF9b, ORF9c ou ORF10.

Toutes les VLP avaient au moins 104 unités infectieuses/ml lorsque leurs titres ont été évalués après 72 heures, à l’exception de l’ORF6 qui code pour une VLP ayant des unités infectieuses indétectables. Les lysats de cellules HEK293T transfectées ont été examinés par immunoblotage de la polyprotéine structurelle du VIH-1, Gag, afin de déterminer si cela était dû à une baisse de l’infectivité ou à une réduction de la formation de particules.

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L’équipe a ensuite produit des VLP VIH-1 rapportant la protéine fluorescente verte (GFP) tout en augmentant les concentrations d’ORF6 ou d’ORF9b comme contrôle pour déterminer s’il y avait une influence dose-dépendante sur l’expression de Gag et la génération de VLP. L’immunoblotting a été utilisé pour examiner le Gag du VIH-1 et l’ORF6/ORF9b dans les lysats de cellules HEK293T transfectées.

Les chercheurs ont également examiné l’effet de l’ORF6 sur l’expression du MLV Gag et de la protéine fluorescente mApple, car ils ont des séquences protéiques entièrement différentes de celles du VIH-1 Gag, afin de déterminer si la suppression de l’ORF6 était uniquement spécifique à l’expression du VIH-1 Gag. Comme pour le VIH-1 Gag, l’expression du MLV Gag et la génération de VLP ont été supprimées par l’ORF6 de manière dose-dépendante.

L’étude a également surexprimé Rae1 avec le Gag du VIH-1 et l’ORF6 dans des cellules HEK293T pour tester l’hypothèse selon laquelle l’ORF6 pourrait inhiber l’expression de la protéine en interagissant avec le complexe Rae1-Nup98. Pour que les niveaux de protéines de l’ORF6 restent cohérents avec ceux de Rae1, l’étude a utilisé le vecteur d’expression original de l’ORF6 dans ce cas. Des co-immunoprécipitations ont été réalisées pour vérifier la connexion de l’ORF6 avec Rae1 et étudier la relation avec Nup98. Des plasmides codant pour la GFP étiquetée par Strep ou l’ORF6 avec Nup98 et/ou HA-Rae1 ont été co-transfectés dans des cellules HEK293T. Les cellules ont été lysées après 24 heures, et un anticorps anti-Strep a été utilisé pour immunoprécipiter la GFP ou l’ORF6.

Résultats

Toutes les cellules, sauf celles transfectées avec pLVX-StrepII-ORF6, ont montré des signes de Gag. Ceci indique que l’expression de l’ORF6 a empêché la génération de VLP en inhibant la synthèse de Gag. Ce n’est que lorsque l’ORF6 était présent en concentrations croissantes que l’expression de Gag diminuait de manière dose-dépendante. L’équipe a vérifié que l’ORF6 produit à partir de ce vecteur réduisait significativement l’infectivité virale et l’expression de Gag. Bien que l’immunoblotting ait démontré une très faible expression de l’ORF3d, de l’ORF9c et de l’ORF10, ce que d’autres ont également constaté, aucun des autres ORF n’a eu d’impact sur l’intensité médiane de fluorescence (MFI) de gag. Dans l’ensemble, nos résultats impliquent que l’ORF6 peut bloquer la production de plusieurs protéines produites par un vecteur.

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L’équipe a également vérifié que l’ORF6 produit à partir de ce vecteur réduisait significativement l’infectiosité virale et l’expression de Gag. De plus, lorsque l’IFM de l’appât a été évalué par cytométrie en flux après la co-transfection de cellules HEK293T avec des plasmides exprimant chaque ORF du SRAS-CoV-2 dans le vecteur étiqueté twin-strep, l’ORF6 a significativement diminué l’IFM par rapport au contrôle. Bien que l’immunoblotting ait démontré une très faible expression de l’ORF3d, de l’ORF9c et de l’ORF10, ce que d’autres ont également constaté, aucun des autres ORF n’a eu d’impact sur l’IFM de l’apiculture. Considérés collectivement, nos résultats impliquent que l’ORF6 peut bloquer la production de plusieurs protéines produites par un vecteur.

Les cellules traitées à la leptomycine B (LMB) présentaient également un ratio Nucl : Cyto GFP mRNA plus élevé que les cellules non traitées, à 0,93 et 0,35, respectivement, même si les niveaux globaux d’ARN GFP étaient réduits. Les cellules exprimant l’ORF6 avaient notamment un rapport Nucl:Cyto GFP mRNA similaire à celui des cellules témoins exprimant l’ORF9b, reflétant la seule légère réduction de l’expression de la GFP, tandis que les cellules exprimant l’ORF6 (LMB) ont augmenté le rapport Nucl:Cyto GFP mRNA et réduit l’expression de la GFP. Dans l’ensemble, les preuves suggèrent que l’ORF6 bloque l’exportation nucléaire dépendante de Rae1 de l’ARNm GFP.

Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont révélé un nouveau mécanisme que le SRAS-CoV-2 utilise pour manipuler l’environnement de la cellule hôte afin d’inhiber les défenses antivirales, ajoutant à notre connaissance des tactiques de reproduction virale qui ont conduit à une catastrophe sanitaire mondiale sans précédent.

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Apasionado del running, vegano a los 25 años y comercial de la ropa, me incorporé al equipo de redacción de AltaVision.news en noviembre de 2021